SDS

 概述

       十二烷基硫酸钠聚丙烯，酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，简称SDS-PAGE）是聚丙烯，酰胺凝胶电泳中最常用的一种蛋白表达分析技术。此项技术的原理，是根据检体中蛋白质分子量大小的不同，使其在电泳胶中分离。在大肠杆菌表达纯化外源蛋白的实验中，SDS-PAGE更是必不可少的操作，其通常用于检测蛋白的表达情况（表达量，表达分布），以及分析目的蛋白的纯度等。

       SDS-PAGE作用机理        蛋白中含有很多的氨基(+)和羧基(-)，不同的蛋白在不同的pH值下表现出不同的电荷，为了使蛋白在电泳中的迁移率只与分子量有关，我们在上样前，通常会进行一些处理(上样缓冲液)。即在样品中加入含有SDS 和β-巯基乙醇的上缓冲液。SDS 即十二烷基磺酸钠（CH3-(CH2)10-CH2OSO3- Na+），是一种阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构； β-巯基乙醇是强还原剂，它可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键。电泳样品加入样品处理液后，经过高温处理，其目的是将SDS 与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构同时使整个蛋白带上负电荷；另外样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，用于监控整个电泳过程；另外样品处理液中还加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加样时样品溶液可以快速沉入样品凹槽底部。当样品上样并接通两极间电流后(电泳槽的上方为负极，下方为正极)，在凝胶中形成移动界面并带动凝胶中所含SDS负电荷的多肽复合物向正极推进。样品首先通过高度多孔性的浓缩胶，使样品中所含SDS 多肽复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带（或称积层）。        电泳启动时，蛋白样品处于pH6.8 的上层，pH8.8 的分离胶层在下层，上槽为负极，下槽为正极。出现了 pH 不连续和胶孔径大小不连续：启动时Cl¯解离度大，Pro¯解离度居中，甘 aaCOO¯解离度小，迁移顺序为（pH6.8）Cl¯> Pro¯ >—COO¯。在 Cl¯与 Pro¯之间和 Pro¯与—COO¯之间都将出现低离子区，同时也出现高电势，高电势迫使 Pro¯向 Cl¯迁移，—COO¯向 Pro¯迁移。如：一个 Cl¯领路，—COO¯推动，蛋白在中间，这样就起到浓缩的作用了。在浓缩胶运动中，由于胶联度小，孔径大，Pro¯受阻小，因此不同的蛋白质就浓缩到分离胶之上成层，起浓缩效应，使全部蛋白质处于同一起跑线上。当蛋白质进入分离胶时，此时Pro¯，Cl¯，甘 aa 离子在 pH8.8 的溶液中，Cl¯完全电离而很快到达正极，甘 aa 电离度加大很快跃过蛋白质，而到达正极，只有蛋白质分子在分离胶中较为缓慢的移动。由于 Pro¯在电泳过程中，受到溶液离子的变化而 pH 值发生变化，但每一瞬间，其所带电荷数除以单位质量是不同的，所以带负电荷多者迁移快，反之则慢，这就现了电荷效应。由于胶孔径小，而且成为一个整体的筛状结构，它们对大分子阻力大，小分子阻力小，起着分子筛效应，也就是蛋白质在分离胶中，以分子筛效应和电荷效应而出现迁移率的差异，最终达到彼此分开。 

       PAGE 胶的聚合原理：甲叉双丙烯。胺和丙烯。酰胺在过硫酸胺的作用下聚合，形成胶，如下图：

        注：催化剂：过硫。酸铵（AP）在隔氧的状态下，最好现配现用，使用新鲜的。         加速催化剂：TEMED，四甲基乙，二胺。催化剂的作用是使单体聚合成网状聚合物。 

        SDS聚丙烯。酰胺凝胶的分离范围： 

丙烯。酰胺浓度（%）

线性分离范围（KD）

15

10-43

12

12-60

10

20-80

7.5

36-94

5.0

57-212

        试剂及主要器材         通常在SDS-PAGE电泳实验中用到以下几种试剂：         1、主要试剂          30％凝胶贮备液：丙烯。酰胺（Acr）29.2g，亚甲基双丙烯。酰胺（Bis）0.8g，加双蒸水至100mL。外包锡纸，4℃冰箱保存，30天内使用。          分离胶缓冲液(1.5mol／L): Tris 18.17g，加双蒸水溶解，6mol/L HCl调pH8.8，定容100mL。4℃冰箱保存          浓缩胶缓冲液(0.5mol／L): Tris 6.06g，加水溶解，6mol/L HCl调8，并定容到100mL。4℃冰箱保存          电极缓冲液(pH8.3)：SDS lg，Tris 3g，Gly 14.4g，加双蒸水溶解并定容到1000mL。4℃冰箱保存。          10％SDS，室温保存          质量浓度10％过硫。酸铵(新鲜配制)         上样缓冲液：5mol／L Tris-HCl pH6.8  1.25mL，甘油2mL，10％SDS 2mL，β-巯基乙醇1mL，0.1％溴酚蓝0.5mL，加蒸馏水定溶至10mL。         考马斯亮蓝R-250染色液（1L）：1g考马斯亮蓝R250，加入450甲醇，100ml冰醋，酸         脱色液（1L）：100ml甲醇，100ml冰，醋酸         未知分子量的蛋白质样品(1mg／mL )        2、实验器材        垂直板电泳槽         电泳仪         长滴管及微量加样器         烧杯(250mL、500m1)、量筒(500mL、 250m1)、培养皿(375px´l125px)         枪头（1ml、200ul、10ul） 

        注射器等

        SDS-PAGE所需溶液：          A液——30％丙稀酰胺（W/V）：丙稀酰胺29.2g，N-N-甲叉双丙稀酰胺0.8g，加入去离子水定容至100mL，pH值不能超过7.0，过滤于棕色玻璃瓶中4℃贮存。         B液——1.5mol/L  Tris·HCl，pH8.8：18.17g（9.09g）Tirs碱，溶于60mL（30mL）去离子水中，加入约3mL(1.5mL)以上的浓盐酸调节pH值至8.8，定容至100mL（50mL）。         C液——1.5mol/L  Tris·HCl，pH6.8：12.1g（6.05g）Tirs碱，溶于60mL（30mL）去离子水中，加入约7mL(3.5mL)以上的浓盐酸调节pH值至6.8，定容至100mL（50mL）。         D液——10％SDS：10g (2g)SDS溶于去离子水中，定容至100mL(20mL)，加热至68℃助溶。         E液——10％过硫。酸铵：5g(0.5g)过，硫酸铵，溶于50mL(5mL)去离子水中；现配现用或分装至0.5mL离心管中冷冻备用。         F液——TEMED(N-N-N`-N`－四甲基乙。二胺)原液，低温保存。         聚丙烯。酰胺（Acrylamide）的作用：丙烯。酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关。  制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择TRIS-HCL系统。         TEMED与AP：AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行。         十二烷基硫酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。 

       注意： 丙烯。酰胺具有很强的 神经毒性 并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。称量丙烯。酰胺和亚甲双丙烯。酰胺（N,N’-Methylenebisacrylamide）时应戴手套和面具。可认为聚丙烯。酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料。

       SDS-PAGE实验标准操作流程        1. 清洗玻璃板        一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉  轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。        2. 灌胶与上样       玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。）        配 12％分离胶，加入 TEMED 后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用 3ml的吸管或10ml 枪吸取适量的胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）      分离胶和浓缩胶的制备：按下表中溶液的顺序及比例，配置12％的分离胶和5.1％的浓缩胶。 

试剂名称

12%的分离胶（8块，35ml）

5.1%的浓缩胶（8块，12ml）

30%凝胶贮备液/ml

14

2

分离胶缓液（pH 8.8）/ml

8.75

浓缩胶缓冲液（pH 6.8）/ml

3

双蒸水/ml

12.25

6.9

10%过硫。酸铵/ul

175

100

TEMED/ul

15

10

       注：分离胶与浓缩胶的浓度计算公式：        A%*Va/V总 =C ，A%为30％凝胶贮备液，        例如，12%的分离胶：0.3*10/25=12%        1.当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等 3min 使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。        2.按前面方法配 5.1％的浓缩胶,加入 TEMED 后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。        3.用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）        4.测完蛋白含量后，计算含 50μg 蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品至 0.5ml 离心管中，加入 5×SDS 上样缓冲液至终浓度为 1×。（上样总体积一般不超过 15μl，加样孔的最大限度可加 20μl 样品。）上样前要将样品于沸水中煮 5min 使蛋白变性。        5.加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3 次，以免交叉污染。       3. 电泳        加样完毕，盖好上盖，连接电泳仪，打开电泳仪开关后，样品进胶前电压控制在100～200V，大约15～20min；样品中的溴酚蓝指示剂到达分离胶之后，电压升到200V，电泳过程保持电压稳定。当溴酚蓝指示剂迁移到距前沿1～50px处即停止电泳，约0.5-1小时。如室温高，打开电泳槽循环水，降低电泳温度。        电泳。        4. 染色、脱色        电泳结束后，关掉电源，取出玻璃板，在长短两块玻璃板下角空隙内，用刀轻 轻撬动，即将胶面与一块玻璃板分开，然后轻轻将胶片托起，指示剂区带中心插入铜丝作为标志，放入大培养皿中染色，使用0.25％的考马斯亮蓝染液，染色2～4h，必要时可过夜。        弃去染色液，用蒸馏水把胶面漂洗几次，然后加入脱色液，进行扩散脱色，经常换脱色液，直至蛋白质带清晰为止。        5. 结果处理       测量脱色后凝胶板的长度和每个蛋白质样品移动距离(即蛋白质带中心到加样孔的距离)，测量指示染料迁移的距离。        按以下公式计算蛋白质样品的相对迁移率(Rm)       相对迁移率＝样品迁移距离(cm)／染料迁移距离(cm)        标准曲线的制作：以各标准蛋白质相对迁移率为横坐标，蛋白质分子量的对数为纵坐标在半对数坐标纸上做图，得到一条标准曲线。 

       测定蛋白质样品的分子量：根据待测蛋白质样品的相对迁移率，从标准曲线上查得该蛋白质的分子量。

        注意事项        APS和TEMED是促凝的，根据温度加入的量是可以变动，一般不超过30％。         玻璃板一定要洗干净，否则制胶是会有气泡。         聚丙烯。酰胺具有神经毒性，操作时注意安全，戴手套。（凝胶以后，聚丙烯。酰胺毒性降低。）         凝胶的时间要严格控制好，一般在20-30min。         点样时，如果孔比较多，尽量点在中央。（点在边上时，跑出的带是斜的）         点样前要排尽胶底部的气泡，防止干扰电泳。         电泳结束后，取胶时，小心把玻璃板翘起（防止再次落下）。         脱色时，尽量多次进行换水。         上样量不宜太高，蛋白含量每个孔控制在10μg-50μg,，一般＜15μl。         做胶时，凝胶时间控制在25min。梳子需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平。         上样时，Marker最好标在中间，边上的孔尽量不要上样。         制胶时，在加APS前尽量不要搅拌，加入APS后可以轻轻搅拌，不要产生气泡。         分离胶缓冲液的pH一定要准确，尽量在20℃左右调掉8.8         安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定螺丝，防止夹坏玻璃板，避免缓冲液渗漏。         凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶。注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡。         微量注射器（加样器）上样时, 注射器不可过低,以防刺破胶体；也不可过高, 样品下沉时易发生扩散，溢出加样孔。         剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分。        注意：温度，时间，光照，APS和TEMED都会对凝胶产生影响